什么是熒光團(tuán)

熒光團(tuán)是能夠產(chǎn)生熒光的分子或分子的一部分。使用適當(dāng)頻率的光照射時(shí)，熒光分子會(huì)從基態(tài)變成激發(fā)態(tài)。但是，處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的。在很短的時(shí)間(一般是fs到ns級(jí))就會(huì)釋放一個(gè)光子，使分子回到較低的能態(tài)。發(fā)射光的波長(zhǎng)相比激發(fā)光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)(能量更低)，因?yàn)檎駝?dòng)、聲子和熱能等機(jī)制會(huì)損耗一部分能量。除非被光漂白破壞——熒光團(tuán)因光致化學(xué)損傷或共價(jià)鍵改變引起的不可逆破壞，單個(gè)熒光團(tuán)能連續(xù)被激發(fā)。一個(gè)特定的熒光團(tuán)在光漂白之前的平均激發(fā)和發(fā)射周期數(shù)取決于它的分子結(jié)構(gòu)和局部環(huán)境；有些熒光團(tuán)僅能發(fā)射幾個(gè)光子就迅速漂白，而有些熒光團(tuán)要穩(wěn)健得多，能夠經(jīng)歷數(shù)千次甚至上百萬(wàn)次周期才發(fā)生光漂白。

熒光顯微鏡濾光片

下圖的顯示了落射熒光顯微鏡中使用的典型熒光濾光片，這種顯微鏡的激發(fā)光和發(fā)射光都會(huì)通過(guò)顯微物鏡。對(duì)于特定應(yīng)用，精心選擇合適的濾光片和反射鏡，能最大程度地提高信噪比。如右邊的原理圖所示，使用三種濾光片來(lái)增強(qiáng)熒光信號(hào)，同時(shí)濾除不需要的光。下面分別討論每種光學(xué)元件。

熒光顯微鏡的激發(fā)濾光片

激發(fā)濾光片只允許熒光激發(fā)波長(zhǎng)峰值附近的窄帶波長(zhǎng)通過(guò)。黃色熒光蛋白激發(fā)濾光片透過(guò)率大于90%的通帶是489到505nm；通帶之外的入射光被部分阻擋(透射區(qū)域附近)，或者被完全阻擋(遠(yuǎn)離帶通波段)。

熒光顯微鏡的二向色鏡

二向色鏡用來(lái)反射波長(zhǎng)小于截止波長(zhǎng)的光，透過(guò)所有其它的波長(zhǎng)。在落射熒光顯微鏡中，二向色鏡將規(guī)定波長(zhǎng)范圍的光引導(dǎo)至樣品和圖像平面。二向色鏡的截止波長(zhǎng)是指透過(guò)率等于50%的波長(zhǎng)。比如在右圖中，熒光蛋白二向色鏡的截止波長(zhǎng)約為515 nm。

將一片二向色鏡相對(duì)入射光成45°放在實(shí)驗(yàn)裝置中，激發(fā)光在二向色鏡的表面反射，然后通過(guò)物鏡入射到樣品上，而樣品發(fā)射的熒光通過(guò)二向色鏡，進(jìn)入光電探測(cè)系統(tǒng)。雖然二向色鏡在熒光顯微鏡中起著至關(guān)重要的作用，但在阻擋不必要的光束時(shí)還不夠理想；通常情況下，波長(zhǎng)小于截止波長(zhǎng)的光有大約90%被二向色鏡反射，而波長(zhǎng)大于這個(gè)值的光大約有90%透射。因此，部分激發(fā)光會(huì)和熒光一起透過(guò)二向色鏡。為了阻止這種不必要的光到達(dá)探測(cè)系統(tǒng)，除了二向色鏡還需要使用發(fā)射濾光片。

熒光顯微鏡的發(fā)射濾光片

發(fā)射濾光片能讓樣品產(chǎn)生的熒光到達(dá)探測(cè)系統(tǒng)，同時(shí)截止不必要的激發(fā)光。與激發(fā)濾光片類似，發(fā)射濾光片只允許熒光發(fā)射波長(zhǎng)峰值附近的窄帶波長(zhǎng)通過(guò)。比如在右圖中，熒光蛋白發(fā)射濾光片透過(guò)率大于90%的通帶是524到546 nm；通帶之外的入射光被部分阻擋(透射區(qū)域附近)，或者被完全阻擋(遠(yuǎn)離帶通波段)。

熒光濾光片濾光片選型的一般原則是在成像端盡可能讓熒光,發(fā)射光透過(guò)，同時(shí)盡可能阻擋激發(fā)光，從而獲得高信噪比信號(hào)。一般會(huì)建議激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片的透射光譜有一定的距離，納宏光電推薦選擇8nm-12nm帶寬。

我們?cè)谂袛酁V光片的參數(shù)一般會(huì)看透射率光譜，但往往熒光相對(duì)于激發(fā)光的強(qiáng)度非常弱，因此選擇濾光片更需要參考阻擋深度光譜圖，OD值，OD值更能直觀地反映濾光片對(duì)光的阻擋特性。在選擇激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片時(shí)，兩者的阻擋深度光譜交點(diǎn)（OD交點(diǎn)）是重要的判斷標(biāo)準(zhǔn)，一般要求寬場(chǎng)光源激發(fā)時(shí)交點(diǎn)OD值大于5，激光激發(fā)時(shí)大于OD6，以實(shí)現(xiàn)較好的熒光信噪比。

深圳納宏光電生產(chǎn)的熒光濾光片組，具有以下濾光片特點(diǎn)：

波長(zhǎng)精準(zhǔn)；

高信噪比；

深截止度；

高可靠性；

產(chǎn)品定制化程度高；